类风湿性关节炎中强度调节化疗药物的近红外

类风湿性关节炎中强度调节化疗药物的近红外响应时空控制的蓝细菌微纳米装置

汇报人：硕士研究生二年级乔萍

研究背景

类风湿性关节炎（rheumatoidarthritis，RA）关节处的缺氧环境使得缺氧诱导因子（hypoxia-induciblefactor-1α，HIF-1α）表达上调，继而导致促炎性M1型巨噬细胞与抗炎性M2型巨噬细胞分化失衡，研究者通过设计了一种蓝细菌微纳米装置，使其在关节处不断产生氧气，下调HIF-1α的表达，继而平衡M1及M2型巨噬细胞，达到治疗类风湿性关节炎的作用。同时引入温敏性水凝胶保证该器件在体内的安全性，此外，该装置持续产生的氧气增强了抗风湿药甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）的治疗效果。

相关文章“NIR-ResponsiveSpatiotemporallyControlledCyanobacteriaMicro-NanodeviceforIntensity-ModulatedChemotherapeuticsinRheumatoidArthritis”于年3月31日发表于杂志ACSAppliedMaterialsInterfaces上，作者来自天津大学医学工程与转化医学学院，通讯作者为董明教授及郑斌教授。

背景知识

类风湿性关节炎是一种炎症性自身免疫性疾病，炎性细胞渗透到关节的滑膜中，会引起滑膜炎及关节损伤。巨噬细胞在RA的炎症反应中有着重要的地位，其两种表型：促炎性M1型及抗炎性M2型，该两者极化之间的平衡已成为治疗类风湿性关节炎的重要靶标之一。RA患者关节处的氧气浓度较低，因而HIF-1α的表达上调，增强促炎性M1巨噬细胞的极化，抑制M2型巨噬细胞的极化。同时，低氧环境也会干扰抗风湿药的作用。因此，增加关节处的氧气浓度成为RA治疗的方向之一。

光遗传学表明光在空间和时间上存在精确控制生化活动的可能性，因而可以在体内开发一种通过光调节氧气产生的光敏传输系统。蓝细菌PCC是研究氧气生产的出色模型，在-nm波长下有良好的光合作用，但是–nm具有较低的组织穿透深度和较高的光毒性，这导致了蓝藻PCC在体内的应用受到限制。相反，近红外光（NIR，–nm）具有深层组织穿透力和低光毒性，已成功用于体内治疗。

研究者前期研究表明镧系元素上转换纳米粒子（lanthanideupconversionnanoparticles，UCNPs）具有独特的光转换功能，能够吸收近红外光并将其转换为蓝光，从而使近红外光在光敏部分的工作得以适用。上转换（UC）是指将两个或多个较低能量泵浦光子转换为较高能量输出光子的反斯托克斯位移过程。上转换机制通常可分为激发态吸收（ESA），能量转移上转换（ETU），光子雪崩（PA），协同能量转移（CET），以及能量迁移介导的上转换（EMU）。两离子过程通常以ETU为主导，其特征是能量从单激发离子（敏化剂/供体）到最终发射的离子（活化剂/受体）的连续转移。

基于此，研究者制备了近红外控制的蓝细菌微纳米装置用于产氧，该装置具有时空选择性，在NIR的控制下，可使得RA小鼠体内产生氧气，并同时用作化疗药物（甲氨蝶呤，MTX）的强度调节剂。蓝细菌微纳米装置由蓝细菌PCC和UCNPs组成，该装置将NIR光转换为蓝光，而后进行光合作用以生成氧气。为了提高该装置在体内的生物相容性，研究者使用了温敏性水凝胶（PLCA-PEG-PLCA，PPP）将其包裹。综上，研究者通过蓝细菌微纳米装置，MTX和温敏性水凝胶（PPP）协同构建了CMP系统以实现协调处理。

CMP系统治疗RA示意图。

（a）蓝光照射下蓝细菌PCC能够产生氧气。（b）蓝细菌微纳米装置的制备及CMP系统的构建。（c）CMP系统体内治疗RA的机制图。

研究内容

一、UCNPs的表征

研究者首先确定蓝细菌光合作用最敏感的波长，即蓝光波段（-nm），且在该波段下蓝细菌能够产生高水平的氧气。需要注意的是，蓝细菌在BG-11培养基中时，任何光源都不会使其产生氧气。UCNPs可以将NIR光转化为蓝紫色光源，并且UCNPs通常被nm的光源激发，但生物组织中的水分子在nm处的吸收系数比在nm处的吸收系数高1个数量级，水分子吸收nm的光并将其转化为热能，局部组织产生强烈的热效应，继而造成局部热损伤，降低NIR光的组织穿透能力。水分子在nm处的吸收非常弱，而稀土Nd3+在该处有很强的吸收，可以通过非辐射共振将能量转移到Yb3+，可以与Yb3+协同敏化（协同敏化是指几种有色物混合后引起的可见光利用率提高的现象。）相提并论。因而将激发光的波长移动到nm处，可以很好的避免水分子吸收带来的热效应。

研究者制备了镧系元素NaYF4：Tm，Yb，Nd上转换纳米粒子（UCNPs）。在nmNIR光的辐射下激发，基态的Nd3+吸收nm的光子达到激发态（Nd：4Ia/2→4F5/2），而能量为4F5/2Nd3+激发态的能级不稳定，随即降低到4F3/2能级，接着，Nd在基态下将能量传输到Yb3+后，Yb3+通过经典ETU上转换过程的三步能量转移将能量转移到Tm3+上，Tm3+发出蓝光（图1E）。同时，研究者使用聚丙烯酸（PAA）对UCNPs进行亲水改性，使其溶解在水溶液中。

研究者合成UCNPs，透射电镜下分析该纳米粒子尺寸为30nm，比例合理（图1B）。图1C显示UCNPs由Na，Tm，Yb，Y，F和Nd元素组成，并且每个元素均均匀地分布在UCNPs中。同时，在nmNIR辐射的激发下，UCNPs在nm处发光，这表明UCNPs已成功制备（图1D）。这些结果表明，上转换纳米粒子具有优异的上转换能力，可以将近红外光转换为蓝光，并有望为体内蓝细菌微纳米装置的光合作用提供光源。

图1UCNPs的表征。（A）蓝光诱导的蓝细菌产氧。（B）UCNPs的TEM图像。比例尺，50nm。（C）UCNPs的高角度环形暗场扫描透射电子显微镜（HAADF-STEM）图像。比例尺，50nm。（D）NIRnm下UCNPs的发射光谱。（E）UCNPs在NIRnm处激发的原理。

二、蓝细菌微纳米装置的表征

蓝细菌微纳米装置由蓝细菌PCC和UCNPs组成（图2A），蓝细菌由有机分子组成，使得其极易被透射电镜的电子束穿透（图2B），透射电镜下可见蓝细菌呈棒状，UCNPs被蓝细菌吞噬，证明蓝细菌微纳米装置已经成功制备。与此同时，共聚焦显微镜显示nmNIR辐照下的蓝细菌微纳米装置能够发射蓝光，为蓝细菌提供光合作用的光源（图2C）。最后，研究者证实在体外nm辐射下的蓝细菌及蓝细菌微纳米装置的均能够产氧（图2D），且蓝细菌微纳米装置的产氧量更高。

蓝细菌微纳米装置具有良好的NIR光控制的产氧能力，这促使研究者使用胶原诱导的关节炎模型验证其体内有效性。研究者将其与MTX联合治疗RA，促进关节处的低氧微环境，提高MTX的治疗效果。为了提高蓝细菌在体内的安全性，研究者使用温敏性的水凝胶包裹它，从而构建出囊括蓝细菌微纳米装置，MTX及温敏性水凝胶的CMP系统。

研究者通过实验表明温敏性水凝胶的粒径随温度的升高而升高（图2E）。如图1HNMR测试表明PLCA-PEG-PLCA的特征峰与预期的化学位移相同（图2F）。当凝胶浓度为质量的20%时，37℃下容易发生相变（图2G），且在该质量分数下，温敏性水凝胶在37℃时经历了一个过渡相（图2H）。

图2蓝细菌微纳米装置的表征。（A）蓝细菌微纳米装置的制备过程和CMP系统的构建。（B）蓝细菌微纳米装置的TEM。（C）通过共聚焦显微镜在NIRnm下激发蓝细菌微纳米装置。（D）在NIRnm辐射下蓝细菌微纳米装置和蓝细菌氧气的产生。（E）不同温度下PLCA-PEG-PLCA的胶束粒径曲线。（F）PLCA-PEG-PLCA三嵌段共聚物的1HNMR谱（G）室温（上）及37℃（下）不同浓度的温敏性水凝胶图像。（H）20%质量浓度的共聚物系统在不同温度下的图像。

三、CMP系统对RA的治疗作用

在该部分内容中，研究者将构建的CMP系统（图3A）于第一、第七天注入小鼠体内，并从第二、第八天起连续三天使用nmNIR辐射（图3B）。关节发炎小鼠足部出现肿胀，使用CMP系统治疗的小鼠，肿胀完全消失（图3C）。由于炎症细胞在关节中积聚并引起炎症，因此RA小鼠的关节处温度会升高，使用热成像记录关节处的温度变化，发现CMP系统治疗的小鼠关节处温度比RA小鼠的关节温度低3.7℃（图3D）。以上结果表明，CMP系统在nmNIR辐射下可抑制RA关节处的炎症反应，减轻关节肿胀。

通过CT进一步评价CMP系统的治疗效果，图3E、F显示，CMP系统处理的小鼠踝关节和脚趾关节的骨侵蚀时最低的，并且于MTX治疗组形成对比，该结果证实了CMP系统与MTX联合治疗的有效性。

图3CMP系统的治疗效果图。（A）CMP系统的制备。（B）CMP系统治疗RA的步骤。（C）不同治疗组中RA小鼠的爪。（D）不同治疗组的RA小鼠爪子的热成像。（E）不同治疗组的小鼠前爪CT测量。（F）不同治疗组小鼠爪侧的CT测量。

四、关节炎症分析及病理检查

蓝细菌微纳米装置通过光合作用产氧，从而抑制HIF-1α的表达，使得M1型巨噬细胞与M2型巨噬细胞能够达到极化平衡。如图4A所示，CMP系统处理过的小鼠关节中HIF-1α的表达水平降低，骨髓及滑膜中的M1型巨噬细胞数量降低（图4B,D），M2型巨噬细胞数量增加（图4C,F），炎症因子IL-6和IL-1β的浓度降低（图4F,G），滑膜炎症得到明显减轻（图4H），HSS及OARSI评分相较于其他治疗组存在明显的统计学差异。以上结果均表明CMP系统通过nmNIR辐射改善了RA关节处的低氧微环境，促进M2型巨噬细胞的极化，从而降低炎症反应。

图4组织中M1及M2型巨噬细胞及炎症因子。（A）荧光显微镜下不同组别小鼠关节中HIF-1α的表达。比例尺，μm。（B,C）不同治疗组中的骨髓M1、M2型巨噬细胞的流式细胞术。（D,E）不同治疗组中滑膜M1、M2型巨噬细胞的流式细胞术。（F,G）血液中炎症因子IL-6，IL-1β的分析（H）不同治疗组关节的苏木精和曙红（H＆E）染色。（I）滑膜炎组织学评分（HSS）。（J）国际骨关节炎协会（OARSI）评分系统对不同组别提取的关节组织评分。数据代表平均值±标准差（SD）（n=5）；*P0.05，**P0.01，且***P0.（单因素方差分析（ANOVA））。

五、CMP系统的生物相容性

研究者通过测试注射了CMP系统的小鼠血液中降钙素（Procalcitonin，PCT）、天冬氨酸转氨酶（aspartateaminotransferase，AST）及肌酐（creatinine，Cr），验证表明该系统未造成全身感染，且未对肝、肾功能造成明显损伤（图5A-C）。同时，研究者还检测了注射CMP系统的小鼠一周内的体温，发现其未产生波动（图5D）。此外，有关嗜中性粒细胞的流式细胞术结果表明，小鼠未受到感染（图5E、F）。综上，CMP系统改善了低氧微环境，使得RA的联合化疗更加有效，同时具有良好的生物相容性。

图5蓝藻微纳米器件体内生物相容性验证。（A-C）降钙素原（PCT），天冬氨酸转氨酶（AST）和肌酐（Cr）分析（D）不同组别的体温变化（E,F）一周内不同组别中性粒细胞（NE）变化。数据代表平均值±SD（n=5）；*P0.05，**P0.01和***P0.（单因素方差分析）。

总结与思考

作者通过构建近红外响应时空控制的蓝细菌微纳米装置，将其与MTX、温敏性水凝胶协同一起构建CMP系统，该系统使得氧气的产生突破了时空限制，可以根据RA的严重程度安排光源的辐照时间，合理供氧。通过降低HIF-1α的表达，平衡M1型与M2型巨噬细胞的极化，从而减轻类风湿性关节炎患者的炎症反应，还极大的提高了化疗药物MTX的治疗效果，温敏性水凝胶的引入在一定程度上保证了该系统的安全性。但蓝细菌在体内的长期安全性、生存活性及有效性还需要进一步研究确认，不可否认的是这样一种治疗策略为类风湿性关节炎的治疗提供了一个全新的方向。

参考文献：

[1]Liu,L.;Hu,F.;Wang,H.;etal.SecretedProteinAcidicandRichinCysteineMediatedBiomimeticDeliveryofMethotrexatebyAlbumin-BasedNanomedicinesforRheumatoidArthritisTherapy.ACSNano,13,?.

[2]Zheng,B.;Wang,H.;Pan,H.;etal.Near-InfraredLightTriggeredUpconversionOptogeneticNanosystemforCancerTherapy.ACSNano,11,–.

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